Pregabalin nuk është një agonist i receptorit GABAA ose GABAB.
Pregabalin është një gabapentinoid dhe vepron duke frenuar disa kanale të kalciumit.Në mënyrë të veçantë, ai është një ligand i zonës ndihmëse të nën-njësisë α2δ të disa kanaleve të kalciumit të varur nga voltazhi (VDCC) dhe në këtë mënyrë vepron si një frenues i VDCC-ve që përmbajnë nën-njësi α2δ.Ekzistojnë dy nën-njësi α2δ që lidhin ilaçin, α2δ-1 dhe α2δ-2, dhe pregabalin tregon afinitet të ngjashëm për (dhe për rrjedhojë mungesën e selektivitetit midis) këtyre dy vendeve.Pregabalin është selektiv në lidhjen e saj me nën-njësinë α2δ VDCC.Përkundër faktit se pregabalin është një analog GABA, ai nuk lidhet me receptorët GABA, nuk shndërrohet në GABA ose në një agonist tjetër të receptorit GABA in vivo dhe nuk modulon drejtpërdrejt transportin ose metabolizmin GABA.Sidoqoftë, pregabalin është gjetur se prodhon një rritje të varur nga doza në shprehjen e trurit të L-glutamic acid dekarboksilazës (GAD), enzimës përgjegjëse për sintetizimin e GABA, dhe për këtë arsye mund të ketë disa efekte indirekte GABAergjike duke rritur nivelet e GABA në tru.Aktualisht nuk ka asnjë provë që efektet e pregabalinës ndërmjetësohen nga ndonjë mekanizëm tjetër përveç frenimit të VDCC-ve që përmbajnë α2δ.Në përputhje me rrethanat, frenimi i VDCC-ve që përmbajnë α2δ-1 nga pregabalin duket se është përgjegjës për efektet e tij antikonvulsante, analgjezike dhe anksiolitike.
A-aminoacidet endogjene L-leucine dhe L-isoleucine, të cilat ngjajnë shumë me pregabalin dhe gabapentinoidet e tjera në strukturën kimike, janë ligandë të dukshëm të nën-njësisë α2δ VDCC me afinitet të ngjashëm si gabapentinoidet (p.sh., IC50 = 71 nM për L- isoleucine) dhe janë të pranishme në lëngun cerebrospinal të njeriut në përqendrime mikromolare (p.sh., 12.9 μM për L-leucinën, 4.8 μM për L-izoleucinën).Është teorizuar se ata mund të jenë ligandë endogjenë të nën-njësisë dhe se ato mund të antagonizojnë në mënyrë konkurruese efektet e gabapentinoideve.Në përputhje me këtë, ndërsa gabapentinoidet si pregabalin dhe gabapentin kanë afinitet nanomolar për nënnjësinë α2δ, fuqitë e tyre in vivo janë në intervalin mikromolar të ulët dhe konkurrenca për lidhjen nga L-aminoacidet endogjene është thënë se ka të ngjarë të jetë përgjegjëse për këtë mospërputhje.

Pregabalin u zbulua se posedonte afinitet 6-fish më të lartë se gabapentina për VDCC-të që përmbajnë nën-njësi α2δ në një studim.Sidoqoftë, një studim tjetër zbuloi se pregabalin dhe gabapentin kishin afinitete të ngjashme për nënnjësinë rekombinante α2δ-1 njerëzore (përkatësisht Ki = 32 nM dhe 40 nM).Në çdo rast, pregabalin është 2 deri në 4 herë më i fuqishëm se gabapentina si një analgjezik dhe, te kafshët, duket të jetë 3 deri në 10 herë më i fuqishëm se gabapentina si një antikonvulsant.